Krevety na trávu jsou důležitým ekonomickým druhem v čínském sladkovodním akvakulturním průmyslu. V posledních letech však v posledních letechHepatopancreatic microsporidium(EHP), parazita infikující hepatopancreas krevety, vážně ovlivnilo průmysl. Protože v současné době neexistuje účinná léčiva nebo vakcína k léčbě tohoto onemocnění, je rychlá a přesná detekce zásadní, aby se zabránilo jejímu šíření.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3krát; B. Zvětšeno 5,0 × 104krát.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Izolace a morfologické pozorování hepatopancreatic microsporidium v litopenaeus vanamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10,3724/sp.j.1118.2018.17430.
Detekce EHP se primárně spoléhá na metody molekulární biologie, přičemž nejčastější je technologie PCR. Přestože PCR nabízí vysokou citlivost, vyžaduje drahé vybavení PCR a specializované laboratorní prostředí, což je nevhodné pro použití v terénu. Aby se tento problém vyřešil, výzkumný tým vyvinul dvě metody rychlé detekce založené na technologii MIRA. Tyto metody nabízejí vysokou citlivost, rychlou reakci a snadnou provoz, což umožňuje efektivní a rychlou detekci EHP v krevetách na místě bez nutnosti komplexního laboratorního vybavení, čímž vyplňuje mezeru v současných metodách detekce.
Amplifikační činidla použitá ve studii:
- Souprava Isotermální rychlé amplifikace DNA (BASIC)
- Isotermální sada pro rychlé amplifikace DNA (typ koloidního zlatého proužku)
Technologie MIRA je multi-enzym izotermální metoda amplifikace amplifikace nukleových kyselin. Její základní princip zahrnuje koordinovaný účinek více funkčních proteinů při okolních teplotách k dosažení rychlé amplifikace nukleové kyseliny, což umožňuje skutečně přenosnou detekci nukleových kyselin na místě.
Metody výzkumu
Extrakce vzorku
Výzkumný tým shromáždil infikované i zdravé trávy krevet vzorky ze tří farmy krevet v liaoningové provincii a extrahoval DNA z hepatopancreasu na krevety.
Design primeru
Byly navrženy tři sady primerů miRA zacílení na gen S8 serinového proteinu EHP (GenBank Accession Number: na 182063). Tento gen má jedinečná aktivní místa a zajišťuje specifičnost detekce.
Detekce mira-age a mira-lfd
(A) Optimalizované reakční teploty RPA-Age. M: DL 500 Marker; N: negativní kontrola; Kmeny 1-5: 25 stupňů, 30 stupňů, 37 stupňů, 39 stupňů a 42 stupňů.
(B) Optimalizované reakční doby RPA-Age. M: DL 500 Marker; N: negativní kontrola; 1: 10 min; 2: 20 minut; 3: 30 minut; 4: 40 min.
(C) Optimalizované reakční teploty RPA-LFD. N: negativní kontrola; 1: 25 stupňů; 2: 30 stupňů; 3: 37 stupňů; 4: 39 stupňů; 5: 42 stupňů.
(D) Optimalizované reakční doby RPA-LFD. N: negativní kontrola; 1: 5 min; 2: 10 minut; 3: 20 min.
K detekci EHP byly použity dvě metody detekce miRA, mira-Age (agarózový gelový elektroforéza) a Mira-LFD (imunoanalýza koloidního zlata). Výzkumný tým optimalizoval reakční teploty a časy experimentováním. Mira-Age amplifikoval cílovou DNA za 30 minut při 37 stupních, zatímco Mira-LFD dokončil amplifikaci za pouhých 10 minut při 37 stupňů, s výsledky činitelné během 5 minut.
Experimentální výsledky
Specifičnost a citlivost
A) Specifičnost detekce RPA-Age. M: DL 1000 Marker; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: Encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Virus syndromu syndromu bílé skvrny; 6: abnormální; N: Negativní kontrola.
(B) Specifičnost detekce RPA-LFD. P: Nosema Bombycis; N: negativní kontrola; 1: EHP; 2: Encephalitozoon; 3: Microsporidia; 4: Virus syndromu syndromu bílé skvrny; 6: Abnormální.
(C) Citlivost RPA-AGE s ředěním gradientu rekombinantních plazmidů. M: DL 500 Marker; N: negativní kontrola; 1: 4,7 × 10^5 kopií/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopie/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopie/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopie/µl; 5: 4.7 Kopie/µl; 6: 4.7 Kopie/µl.
(D) Citlivost RPA-LFD s ředěním gradientu rekombinantních plazmidů. N: negativní kontrola; 1: 4,7 × 10^5 kopií/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopie/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopie/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopie/µl; 5: 4.7 Kopie/µl; a 6: 4,7 kopií/µl.
Experimenty prokázaly, že technologie MIRA má vysokou specificitu a přesně detekuje EHP, aniž by reagovala na jiné patogeny. Pokud jde o citlivost, obě metody měly detekční limit 4,7 kopií/ul, výrazně vyšší než citlivost tradiční PCR.
Klinické testování vzorků
Výsledky testování 30 klinických vzorků ukázaly, že Mira-Age a Mira-LFD měly míru pozitivity 70%, o něco nižší než 80%QPCR, ale výrazně vyšší než tradiční 56,7%.
Vyhlídky na aplikaci
Metody detekce založené na Mira umožňují rychlé amplifikaci cílových genů při konstantních teplotách. Zejména metoda MIRA-LFD může poskytovat výsledky za pouhých 10 minut bez nutnosti složitého laboratorního vybavení, což je ideální pro použití na místě v farmách s krevetami. Vysoká citlivost a specificita této technologie z něj činí efektivní nástroj pro včasnou detekci a kontrolu EHP, čímž se chrání zdraví a rozvoj zemědělského průmyslu krevet.
Mezi těmito metodami je imunoanalýza koloidního zlatého laterálního toku (Mira-LFD) obzvláště vhodné pro aplikace na místě díky jeho jednoduchosti a intuitivním výsledkům. Farmáři krevet trávy mohou rychle detekovat a reagovat na infekce EHP, zlepšit schopnosti kontroly nemocí, výrazně zvýšit efektivitu zemědělství a snižovat ekonomické ztráty.