《Zřízení metody detekce mikropteru Salmoides Rhabdovirus založené na systému CRISPR CAS13A Express
Zhang Minlin, Huang Fengqi, Zuo Xiaoling, Liang Jiantao, Liang Kaishan, Dan Jinhong, Li Zongyang, Yu Jie, Luo Liyuan, Xie Zijie, Zhao Huihong, Wang Qing, Wang qing, založený na detekční metodě [System [CAS13A SYSTERS [ Chinese Journal of Hydrobiology, 2024, 48 (2): 283-291. Doi: 10,7541/2023.2023.0199
Micropterus Salmoides, také známý jako kalifornský bass nebo americký černý bass, je sladkovodní ryba pocházející z Severní Ameriky. V posledních letech se stala celosvětově důležitými chovanými rybami kvůli své vysoké tržní poptávce: Micropterus Salmoides má pevné maso, několik kostí, chutné chuť, bohatou výživu, zejména vysoký bílkovina a nízký tuk, který uspokojuje poptávku spotřebitelů po zdravých potravinách. Tržní cena je proto relativně vysoká a často se používá na trhu s špičkovým stravováním. Rychlý růst: Micropterus Salmoides roste rychle a obecně může dosáhnout komoditních specifikací za 6-8 měsíce. Je vhodný pro chov s krátkým cyklem a může rychle realizovat výnosy z investic. Silná odolnost proti chorobám: Ve srovnání s jinými chovanými rybami má Micropterus Salmoides silnou přizpůsobivost životnímu prostředí, méně rozsáhlé ohniska onemocnění a snižuje chov. Ekologické šlechtění: Largemouth Bass může být smíchán s jinými sladkovodními rybami, jako je stříbrný kapr a trávník, což pomáhá dosáhnout ekologické rovnováhy rybníků a maximalizovat využití zdrojů, dále zlepšit účinnost chovu a další faktory. Je vítán hostry a zemědělci akvakultury a jeho škálostní škála v posledních letech rychle rostla.
Ačkoli mikropterus salmoidy jsou relativně rezistentní na onemocnění, mohou stále trpět některými chorobami za špatných chovných podmínek. Mezi nimi je Micropterus Salmoides Rhabdovirus (MSRV) nesmírně škodlivé: poprvé byl objeven na Floridě v USA v roce 1991. Virus byl původně detekován v divokých largemouth basových populacích a poté se postupně šířil do mnoha sladkovodních jezer a nádrží ve Spojených státech a poté se stal jedním z hlavních patogenů largemouth bas.
Klinické příznaky nemocných ryb
Odpověď: Zdravá basa largemouth, šipka označuje žloutkový vak; B: Šipka nemocné largemouth basy označuje žloutkový vak.
Zdrojem přenosu je často infikován s potěr nebo dospělými rybami, znečištěnými vodními útvary a divoké ryby nesoucí virus; Tento virus může být přenášen přímým kontaktem, fekálním vylučováním a vodními útvary a je pravděpodobnější, že se vyskytuje za špatnou kvalitu vody nebo chovných podmínek s vysokou hustotou. difúze. Virus může způsobit letargii, putování, břišní otoky a zkreslení těla u juvenilních ryb a také vyvolávat nekrotické vředy a krvácení z více orgánů. Po nakazení míra úmrtnosti přesahuje 90%.
Klinické příznaky uměle infikovaných mikropterů salmoides
A: Zdravý largemouth bass; B, C, D: Uměle infikované basy largemouth.
Každý rok se kvůli MSRV ztratí více než 30% Micropterus Salmoides Fry. V současné době jsou metody léčby a detekce pro virus stále nezralé a neexistuje žádný specifický lék na jeho léčbu. Proto je velmi nutné detekovat virus včas před infekcí a přijmout účinná preventivní opatření, která mohou do jisté míry snížit ztráty v chovném procesu;
Kromě toho je obtížné provádět detekci na místě bez komplexního detekčního zařízení se stávající technologií detekce. Vzhledem k této výzvě vyvinul výzkumný tým zemědělské univerzity v Jižní Číně novou detekční metodu kombinující Mira s systémem CRISPR. Tato metoda má silnou specificitu, vysokou citlivost a jednoduchý provoz, což výrazně zlepšuje účinnost detekce MSRV a také pomáhá detekovat MSRV co nejdříve a přijímat prevenci a kontrolu.
Screening kombinace primerů Mira
K amplifikaci genového fragmentu obsahujícího cílovou sekvenci byly použity dva páry různých primerů miRA a amplifikované produkty byly podrobeny elektroforéze agarózového gelu. Elektroforézní graf byl umístěn v poloze 100 bp a ve všech třech pruzích se objevily jasné pásy, což naznačuje, že existují nespecifické amplifikační produkty. Amplifikované cílové pásy při 250 bp v pruhu 2 a 3 byly kvantitativně analyzovány pomocí softwaru Image J a výsledky kvantitativní analýzy byly vyjádřeny „šedou hodnotou“. Z výsledků analýzy lze dojít k závěru, že čím nižší je šedá hodnota, tím vyšší je rychlost využití primeru, tím vyšší je účinnost amplifikace vazebné a zesílení primeru.
Výsledky ukázaly, že specifická účinnost amplifikace vazby byla vysoká, když byl použit dvojice primerů miRA-F2/R2.
Screeningová elektroforéza Gel Image a analýza šedé hodnoty
A. Elektroforézní pruh M: 2000 bp DNA marker; Elektroforézní pruh 1. Amplifikace negativního vzorku DNA; Elektroforézní pruh 2. Pár primerů Mira-F1/R1 amplifikuje cílový fragment (224 bp, jak je znázorněno v krabici); elektroforézní pruh 3. Primer Primer Mira-F2/R2 zesiluje cílový fragment (255 bp, jak je znázorněno v krabici); b. Analýza pásma šedá hodnota (jak je znázorněno v krabici)
Detekční systém CRISPR/CAS13A
Po dokončení reakce detekčního systému CRISPR/CAS13A je ozářena ultrafialovým světlem pro pozorování výsledků.
Schéma jasu jasujícího fluorescence CRISPR/CAS13A
1-3. Celý systém se standardem RNA přidal; 4. přidaná CrRNA; 5. Přidán žádný protein Cas13a; 6. Přidána žádná reportérová sonda SsRNA; 7. Negativní kontrola
Optimální reakční systém CRISPR/CAS13A-MSRV
Provedli jsme experimenty pomocí standardů RNA a amplifikované vzorkové RNA. Rychlost polohování cílové RNA byla lepší s CRRNA2 než u crRNA1. CrRNA1 měl silnější konečný signál fluorescence než CRRNA2. Smíšené použití crRNA 1+ crRNA2 ve stejných poměrech by mohlo kombinovat výhody obou a dosáhnout lepší účinnosti reakce.
Optimalizace CRISPR/CAS13A-MSRV Detekční reakční podmínky a výsledky detekce
A. Porovnání výsledků detekce standardní RNA pomocí crRNA s různými spacer sekvencemi;
b. Porovnání dat fluorescenčního signálu standardní RNA detekované detekčním systémem při různých teplotách;
C. Porovnání dat fluorescenčního signálu standardních RNA detekovaných pomocí reportérových sond RNA s různými koncentracemi;
d. Porovnání výsledků detekce standardních RNA detekovaných pomocí komplexů sondy Cas13a/crRNA s různými koncentračními poměry;
Pro prozkoumání vlivu reakční teploty na detekční systém byly nastaveny různé reakční teploty 31 stupňů, 34 stupňů, 37 stupňů a 41 stupňů. Optimální reakční teplota detekčního systému CRISPR/CAS13A-MSRV byla 37 stupňů.
Pro prozkoumání účinku koncentrace reportérové sondy SsRNA na detekční systém, v rámci testovacího rozsahu byla intenzita fluorescence pozitivně korelována s koncentrací reportérované sondy SsRNA. Detekční účinek koncentrace ssRNA reportérové sondy se příliš nelišil na 500-700 nmol/l. S ohledem na skutečné ekonomické problémy byla optimální koncentrace sondy SSRNA reportéry 500 nmol/l.
Pro prozkoumání účinku různých poměrů Cas13a a CrRNA reakce na detekční systém, když poměr Cas13a: crRNA byl 4: 1 a 3: 1 na základě poměru 100 nmol/l na část, dosáhl nasycení; Když bylo množství Cas13a konstantní, intenzita fluorescenčního signálu nebyla pozitivně korelována se zvýšením množství crRNA. Proto, když je poměr Cas13a k CrRNA 2: 1, může detekční systém CRISPR/CAS13A-MSRV dosáhnout maximální detekční aktivity.
Hodnocení citlivosti
Za účelem prozkoumání minimální koncentrace detekce MSRV pomocí detekčního systému CRISPR/CAS13A-MSRV byl standard RNA zředěn 10krát v sérii a detekován detekčním systémem CRISPR/CAS13A-MSRV. Detekční systém CRISPR/CAS13A-MSRV může detekovat alespoň 100FM cílové RNA MSRV. Pokud je cílová koncentrace RNA nižší než 100 ° C, fluorescenční signál detekovaný strojem se významně neliší od signálu s kontrolou prázdného. Proto může detekční systém CRISPR/Cas13A-MSRV detekovat nejméně 100FM msrv ssRNA.
Vyhodnocení specifičnosti detekčního systému CRISPR/CAS13A-MSRV pro MSRV
Ukázkové testování
U vzorků nemocných ryb se zjevnými známkami nemoci odebraných z farmy mořských basů jsme ověřili, zda patogen infikovaný nemocnými rybami byl MSRV. Pro amplifikaci PCR jsme použili primery specifické pro proteinovou sekvenci MSRV CapsiD a poslali odpovídající pásy v elektroforézním diagramu pro testování. Po srovnání jsme potvrdili, že to byl MSRV.
Potvrzení informací o sekvenci MSRV
A. Amplifikace PCR 228 bp produktového pásma primerů MSRV; b. Proteinová sekvence MSRV CAPSID ve srovnání s NCBI jsou odvážné sekvence proti proudu a navazujícími místy primerů a stínované oblasti jsou cílovými místy pro vazbu CRISPR/CAS13A-MSRV CRRNA1
Nemocné vzorky ryb infikované MSRV byly předem ošetřeny a předzenikovány pro virovou RNA a poté testovány s negativní kontrolní skupinou. Současně byla cDNA vzorků extrahována pro srovnání s konvenční qPCR. Pozitivní vzorky (č. 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 a 15) detekované detekčním systémem CRISPR/CAS13A-MSRV byly stejné jako výsledky konvenčního qPCR, kde hodnota CQ QPCR byla mezi 18 a 25; Zatímco počet negativních vzorků (č. 1, 2, 4, 5, 9, 10 a 11) byl větší než 38, což naznačuje, že vzorky nenesly virus MSVR. Stručně řečeno, detekční údaje o detekčním systému CRISPR/CAS13A-MSRV a konvenčního RT-QPCR byly konzistentní, což naznačuje, že detekční systém CRISPR/CAS13A-MSRV je proveditelný a dokáže do určité míry nahradit původní konvenční a komplikované detekční metody.
Vertikální srovnávací graf vzorkovacích údajů o detekci qPCR s qPCR a CRISPR
A. Detekce qPCR detekce MSRV klinického prahového prahové hodnoty číselného cyklu; Číslo detekovaného vzorku cyklu bylo porovnáno s negativním číslem referenčního cyklu pomocí analýzy t-testů (** P<0.01);
b. Cas13a v kombinaci s detekcí MIRA detekce fluorescenčního diagramu klinického vzorku MSRV; Hodnota fluorescence detekovaného vzorku byla porovnána s hodnotou negativní referenční fluorescence pomocí analýzy t-testů (** P<0.01)
Stručně řečeno, metoda detekce detekce CRISPR/CAS13A-MSRV stanovená v této studii nevyžaduje drahé experimentální nástroje, což činí rychlou, přesnou a pohodlnou detekci na místě. Proto, pokud je tato metoda detekce použita k včasnému objevení MSRV ve skutečném chovném procesu a přijímání cílených a účinných opatření, může výrazně snížit ztráty způsobené chorobami v chovném procesu. Tato metoda detekce je navíc rychlá, vysoce citlivá a specifická a má skvělé vyhlídky na aplikaci a propagaci.