V oblasti molekulární diagnostiky je polymerázová řetězová reakce (PCR) dlouho považována za zlatý standard pro detekci nukleových kyselin. Technologie izotermické amplifikace, reprezentované rekombinázovou polymerázovou amplifikací (RPA), si v posledních letech získaly stále větší pozornost díky své rychlosti, jednoduchosti a vhodnosti pro-testování na místě.
Přestože PCR i RPA jsou metody amplifikace nukleových kyselin, výrazně se liší v pracovních principech, požadavcích na vybavení a aplikačních scénářích, takže každá technologie je vhodná pro různé diagnostické potřeby.
1. Základní principy: Tepelné cyklování vs. konstantní-zesilování teploty
PCR je biochemický proces schopný amplifikovat jednu molekulu DNA do milionů kopií během krátké doby. Reakce se opírá o opakované tepelné cyklování a skládá se ze tří hlavních kroků:
1. Denaturace (90–95 stupňů) – Dvou-řetězcová DNA je rozdělena do jednotlivých řetězců.
2. Žíhání (55–65 stupňů) – Primery se vážou na cílové sekvence.
3. Prodloužení (72 stupňů) – DNA polymeráza syntetizuje nová vlákna DNA.
Prostřednictvím těchto teplotně-řízených cyklů je cílová DNA amplifikována exponenciálně s vysokou přesností. PCR však vyžaduje složité nástroje tepelného cyklování a její dokončení obvykle trvá 1–2 hodiny.
Naproti tomu RPA pracuje při konstantní teplotě 37–42 stupňů, což umožňuje rychlou amplifikaci nukleové kyseliny bez tepelného cyklování. Technologie spoléhá na koordinované působení rekombinázových proteinů, jednořetězcových DNA-vazebných proteinů a řetězcové- vytěsňující DNA polymerázy k dosažení vysoce specifické cílové amplifikace za izotermických podmínek.
DNA polymeráza použitá v RPA má aktivitu vytěsňování vlákna, ale postrádá aktivitu 5'→3' exonukleázy. Během amplifikace se vnější primery rozšiřují podél templátového vlákna. Když se setkají s dvouvláknovými oblastmi syntetizovanými z vnitřních primerů, polymeráza nemůže degradovat downstream vlákno a místo toho jej vytěsní, čímž vytvoří nové amplifikační produkty.
Celá reakce je dokončena za konstantní teploty, což eliminuje potřebu složitého přístrojového vybavení a umožňuje skutečné{0}}testování{1}}péče a terénní-testování. Začleněním reverzní transkriptázy lze RPA také použít k detekci cíle RNA.
Výsledky amplifikace lze analyzovat pomocí různých formátů odečítání, včetně detekce koncových bodů, sledování fluorescence v reálném čase{0}, laterálních průtokových testů, a lze je dále integrovat se systémy CRISPR-Cas, mikrofluidikou nebo sekvenováním příští{2}}generace (NGS) pro pokročilý vývoj testů.
Aplikační scénáře: Laboratorní přesnost vs. -rychlé testování na místě
PCR se stala jednou z nejcennějších molekulárních diagnostických technologií a zůstává zlatým standardem pro testování nukleových kyselin.
Díky vysoké přesnosti,{0}}efektivitě nákladů a škálovatelnosti je PCR široce používána v klinické diagnostice, centralizovaných laboratořích, výzkumných institucích a rozsáhlých screeningových programech, kde je snadno dostupná infrastruktura a vyškolený personál.
RPA na druhou stranu nabízí jasné výhody v rychlé-diagnostikě na místě. Se zesílením dokončeným za pouhých 20 minut, minimálními požadavky na vybavení a jednoduchým ovládáním je RPA ideální.
- Primární zdravotní péče a pohotovostní zařízení
- Celní a hraniční kontrola
- Terénní screening chorob zvířat a rostlin
- Testování bezpečnosti potravin a životního prostředí
V kombinaci s přenosnými zařízeními a bočními průtokovými proužky umožňuje RPA rychlé a spolehlivé molekulární testování mimo tradiční laboratoře.
MIRA (multienzymová izotermická rychlá amplifikace)je patentovaná technologie izotermického zesílení společnosti Amp Future. Patří do stejné technické rodiny jako RPA a je inspirován přirozenými rekombinačními a opravnými mechanismy DNA, využívajícími více funkčních enzymů k dosažení rychlé amplifikace nukleové kyseliny za konstantní teploty.
MIRA využívá koordinovaný systém pěti klíčových enzymů, včetně helikázy, rekombinázy, jednořetězcového proteinu vázajícího DNA- a DNA polymerázy, které umožňují:
- Široký rozsah provozních teplot: 25-45 stupňů
- Rychlé zesílení: výsledky do 20 minut
- Vysoká citlivost a specificita
- Zvýšená bezpečnost a snížené riziko kontaminace
MIRA je technologie amplifikace nukleové kyseliny speciálně navržená pro skutečné testování na-místě a místě--péče.
Na základě platformy MIRA vyvinul Amp Future komplexní portfolio produktů pro rychlý molekulární POCT, včetně:
Činidlo pro rychlé uvolňování nukleových kyselin:
Amplifikovatelná nukleová kyselina se získá během 5 minut při teplotě místnosti; nízká inhibice umožňující plné naplnění vzorku až 50 μl; přeprava a skladování při pokojové teplotě, není nutná ochrana před světlem.
Izotermické činidlo pro amplifikaci nukleových kyselin:
Amplifikace dokončena za 5-20 minut, rychlá a účinná; různé formy činidel (lyofilizovaný prášek, lyofilizované mikrokuličky atd.); různé metody prezentace výsledků (elektroforéza, fluorescence, testovací proužky).
Miniaturizovaná přenosná zařízení:
Digitální izotermické detektory, kapesní testovací nástroje-snadno držitelné v jedné ruce, vybavené power bankou, osvobozující vás od omezení v laboratoři a přináší přesné testování nukleových kyselin do terénu.
Jeden/více testovacích proužků:
Optimalizováno na základě metodiky MIRA pro lepší kompatibilitu; v kombinaci s technologií MIRA zvýrazňující pohodlí.
Plně automatický analyzátor amplifikace nukleových kyselin:
Vyžaduje pouze jednu operaci vložení vzorku pro plně automatizovanou detekci; limit detekce až na jednu kopii; izotermické zesílení a automatický uzávěr snižují riziko kontaminace.
Balíček rychlého testování na-stránce:
Testování-na-místě, kdykoli a kdekoli, vše v jednom balíčku; dokončí testování za 30 minut, přesné a citlivé.
Pro více informací o produktech nebo řešení nás neváhejte kontaktovat.