Laditelné řízení aktivity Cas12 podporuje univerzální a rychlou detekci nukleových kyselin-v jednom nádobě
Vydalo: University of Science and Technology of China
Journal: Nature Communications
Dopadový faktor: 14.7
S využitím technologie MIRA byla vyvinuta univerzální-metoda fluorescenční detekce nukleových kyselin (ANSURVEY) v jedné nádobě na bázi heparinu sodného. Studie ukázaly, že heparin sodný může regulovat aktivitu štěpení Cas12a tím, že interferuje s procesem vazby Cas12a-crRNA. Úpravou koncentrace heparinu sodného je SURVEY kompatibilní s klasickými i suboptimálními sekvencemi PAM a je použitelný pro více podtypů Cas12. Tato metoda s dobou detekce pouhých 15-20 minut dosahuje citlivosti a specificity přesahující 95 % pro detekci pseudoviru opičích neštovic, viru chřipky A a SARS-CoV-2. Je to nízkonákladové-a poskytuje novou metodu detekce v místě péče pro lékařskou terénní diagnostiku a monitorování prostředí, řešící obtížnou rovnováhu mezi senzitivitou a specificitou v tradiční diagnostice CRISPR.
1. Studium mechanismu účinku heparinu sodného
Do systému Cas12a-crRNA obsahujícího 10nM cílovou DNA byla přidána fluorescenční sonda a byl pozorován rychlý a významný fluorescenční signál bez přidání heparinu sodného. Když bylo přidáno 0,2 ug/ml heparinu sodného, fluorescenční signál byl podobný jako u kontrolní skupiny, což naznačuje, že heparin sodný výrazně inhiboval trans-štěpící aktivitu Cas12a. 0.2ug/ml heparinu sodného je minimální inhibiční koncentrace. Jak se koncentrace heparinu sodného zvyšuje z 0,2 ug/ml na 0,5 ug/ml, cis-štěpná aktivita Cas12a je postupně inhibována a při 0,5ug/ml je trans{14}}štěpná aktivita téměř úplně inhibována. Studie mechanismu účinku heparinu sodného ukázaly, že záporně nabité skupiny heparinu sodného interferují se správnou vazbou crRNA na Cas12a a mohou ovlivnit tvorbu binárního komplexu crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a one-detekce hrnce
Po ověření mechanismu účinku heparinu sodného článek prozkoumal strategii detekce v jedné nádobě (MIRA-Cas12a), která kombinuje amplifikaci MIRA a fluorescenční detekci zprostředkovanou Cas12a- v jedné zkumavce.
V nepřítomnosti heparinu sodného neprodukovala kombinace MIRA{0}}Cas12a žádný významný fluorescenční signál v rozmezí koncentrace cílového genu 0,1 aM až 10 fM. Při 40 µg/ml heparinu sodného byl pozorován významný fluorescenční signál v rozmezí cílové koncentrace 1aM (≈0,6 kopií/μL, objem=30μL) až 10fM (≈6 000 kopií/μL, objem=30μL), což prokazuje více než 10 000násobné zlepšení v citlivosti na sodík ve srovnání s heinovým systémem.
Koncentrace templátu viru opičích neštovic byla 10 fM a Cas12a-crRNA (100 nM) byla použita k detekci cílových genů f31 a b6r. Amplifikační reakce byla ukončena v 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 a 20 minutách a obsah amplifikačního produktu MIRA v různých časech byl analyzován na agarózových gelech. Výsledné produkty byly poté analyzovány na agarózových gelech ve třech různých nastaveních: MIRA-heparin sodný bez Cas12a, MIRA-Cas12a bez heparinu sodného a MIRA-Cas12a s heparinem sodným. Výsledky ukázaly, že v nepřítomnosti heparinu sodného byla amplifikace nukleové kyseliny bráněna kvůli vysoké cis-štěpící aktivitě Cas12a. Přidání sodné soli heparinu však významně zvýšilo amplifikaci nukleové kyseliny v důsledku snížení cis-štěpící aktivity Cas12a.
Článek demonstruje, že univerzální jedno{0}}potenciální fluorescenční metodu detekce nukleových kyselin (ANSURVEY) založenou na heparinu sodném lze dosáhnout pomocí klasických PAM i suboptimálních PAM sekvencí. Kromě toho jsou v metodách CRISPR-Dx široce používány kromě LbCas12a také AsCas12a a AapCas12b. V systému používajícím MIRA-AsCas12a byla fluorescence pozorována pouze v přítomnosti 40 ug/ml heparinu sodného, což ukazuje, že dokáže detekovat 1fM genů f31 a b6r. V nepřítomnosti heparinu sodného může MIRA-AapCas12b detekovat gen 1 f31 a b6r. Podání 20 ug/ml heparinu sodného nejen zrychlilo rychlost detekce MIRA-AapCas12b, ale také zvýšilo intenzitu fluorescence. Tato zjištění naznačují, že metoda one{24}}poté vyvinutá s použitím dávkování heparinu sodného je použitelná i pro jiné podtypy Cas12.
