Viditelná a rychlá detekce kočičího chaphamaparvoviru pomocí multienzymové izotermické rychlé amplifikace a testu laterálního průtoku
Časopis: Hranice v buněčné a infekční mikrobiologii
Impact Factor:4.6
Kočičí chaphamaparvovirus(FeChPV)je nový parvovirus, poprvé zjištěný u koček s průjmem v Kanadě v roce 2019. Jeho patogenita a molekulární charakteristiky zůstávají nejasné a vykazuje hostitelskou a genetickou rozmanitost, což vyžaduje další epidemiologické zkoumání. V současné době neexistuje žádná standardizovaná metoda pro detekci FeChPV.
Metoda multienzymové izotermické rychlé amplifikace-měřicí tyčinky s laterálním průtokem (MIRA-LFD)se úspěšně používá pro detekci různých virů, nabízí výhody jako rychlost, jednoduchost a není potřeba přesných přístrojů. Výzkumný tým vytvořil metodu MIRA-LFD vhodnou pro FeChPV k řešení problémů při klinické detekci na nejnižší úrovni. Bez spoléhání se na přesné přístroje,metoda MIRA-LFD dokončila detekci FeChPV při 37 stupních během 20 minut a nevykázala žádnou zkříženou-reaktivitu s jinými viry. Detekční limit byl 32,3 kopií/μl,10krát vyšší než u metody PCR. Kromě toho metoda MIRA-LFD detekovala 29 FeChPV-pozitivních vzorků u 417 koček s průjmem, s mírou pozitivity mírně vyšší než u metody nested PCR. Tyto výsledky naznačují, že zavedená metoda MIRA-LFD pro detekci FeChPV je účinná, ekonomická, spolehlivá a jednoduchá metoda, která přispívá k včasné prevenci a kontrole infekce FeChPV.
1.Experimentální metody
Klinické vzorky:Vzorky rektálních výtěrů použité v této studii byly odebrány od 632 koček (včetně 417 s průjmem a 115 zdravých koček) a 474 psů (včetně 342 s průjmem a 132 zdravých psů) na veterinárních klinikách v provinciích Guangdong, Henan, Anhui, Zhejiang a autonomní oblasti Vnitřní Mongolsko2 a mezi 2022.
Amplifikace nukleových kyselin:Do systému MIRA byla přidána extrahovaná DNA nukleová kyselina. Rekombináza a primery vytvořily komplex; s pomocí pomocných proteinů a jednořetězcových vazebných proteinů napadli templát dvouřetězcové DNA. Primery se navázaly na homologní komplementární oblasti za vzniku oblasti D-smyčky, zatímco rekombináza se z komplexu rozebrala. Polymeráza se navázala na 3' konec primerů a zahájila syntézu DNA, exponenciálně amplifikovala cílovou oblast na templátu. Tento proces probíhal rychle a efektivně, čímž bylo dosaženo ultra{8}}rychlé amplifikace cílového fragmentu za pouhých 15 minut.
Vývoj barvy testovacího proužku:Produkt amplifikace nukleové kyseliny byl zředěn 1:10, aplikován na testovací proužek a výsledky byly odečteny po 5 minutách.
Celý proces od amplifikace nukleové kyseliny po vývoj barvy testovacího proužku trval pouhých 20 minut.
V experimentu byly použity produkty Amp-future Biological:
Ve studii byly testovány čtyři navržené sady kombinací specifických-sond primerů. Pro prezentaci výsledků byly použity jak elektroforéza na agarózovém gelu, tak testovací proužky nukleových kyselin. Všechny čtyři kombinace primerů-sond mohly detekovat virus FeChPV. Podle výsledků elektroforézy na agarózovém gelu vykazovala kombinace FeChPV-4 nejjasnější cílový pás, takže tato kombinace byla vybrána pro následné testování.
Podle výsledků elektroforézy na agarózovém gelu poskytla amplifikace po dobu 5, 10, 15 a 20 minut cílový pás. Intenzita cílového pruhu dosáhla vrcholu po 15 minutách amplifikace, čímž se stanovilo 15 minut jako optimální reakční doba pro tento test. Amplifikace při 36 stupních, 37 stupních, 38 stupních, 39 stupních a 40 stupních vytvořila cílový pás, s nejjasnějším pásem pozorovaným při 39 stupních, což stanovilo 39 stupňů jako optimální reakční teplotu pro tento test.
(Obrázek A: 1: Amplifikace 5 minut; 2: Amplifikace 10 minut; 3: Amplifikace 15 minut; 4: Amplifikace 20 minut) (Obrázek B: 1: Amplifikace 36 stupňů; 2: Amplifikace 37 stupňů; 3: Amplifikace 38 stupňů; 4: Amplifikace 40 stupňů; 5)
2. Výkon detekce
Citlivost:
(Obrázek A: Výsledky MIRA prezentované pomocí elektroforézy na agarózovém gelu)
(Obrázek B: Výsledky Nested PCR prezentované pomocí elektroforézy na agarózovém gelu)
(Obrázek C: Výsledky MIRA prezentované pomocí testovacích proužků nukleových kyselin)
Vzorky byly podrobeny 10násobnému sériovému ředění počínaje 3,23 x 106 kopií/μl. Nested PCR s elektroforézou na agarózovém gelu mohla stabilně detekovat 3,23×10² kopií/μl; MIRA s elektroforézou na agarózovém gelu a MIRA s testovacími proužky nukleových kyselin mohly obě stabilně detekovat 3,23 × 101 kopií/μl.
Metoda MIRA vykazovala konzistentní citlivost při použití dvou různých formátů prezentace výsledků a citlivost metody MIRA byla lepší než u nested PCR.
Specifičnost:
(1: FeChPV, kočičí chaphamaparvovirus; 2: FPV, virus kočičí panleukopenie; 3: FeAstV, kočičí astrovirus; 4: FBoV, kočičí bocavirus; 5: CachaV, psí chaparvovirus; 6: negativní kontrola)
Nově zavedená metoda MIRA-LFD detekovala pouze FeChPV a nevykazovala žádnou zkříženou-reaktivitu s jinými referenčními viry, což ukazuje na dobrou specifitu.
3.Shrnutí studie
Tato studie vytvořila metodu MIRA-LFD pro detekci FeChPV bez potřeby vysoce přesných{1}}přístrojů. Jako účinná, ekonomická a spolehlivá detekční metoda s vysokou senzitivitou a specificitou je metoda MIRA-LFD vhodnější pro klinickou detekci, poskytuje technickou podporu pro včasnou prevenci a kontrolu infekce FeChPV.
4.AMP-BUDOUCNOST BIOTECH
Multienzymová izotermická rychlá amplifikace nukleové kyseliny MIRA je technologie, která skutečně umožňuje-rychlou detekci na místě.
Technologie MIRA je založena na mechanismu opravy genové rekombinace in vivo, který se opírá o synergické působení více funkčních proteinů při pokojové teplotě k dosažení rychlé (5-}20 minut), citlivé, specifické a bezpečné amplifikace nukleové kyseliny při pokojové teplotě (25 stupňů – 45 stupňů). Vzhledem k izotermické povaze technologie MIRA má nízké nároky na vybavení a jednoduché ovládání. Prostřednictvím miniaturizovaných přenosných zařízení jej lze použít při testování v první linii v různých aplikačních scénářích a přináší rychlé a přesné testování nukleových kyselin do prostředí, jako je POCT, domácí testování, zemědělská pole a-vymáhání práva na místě. Společnost Amp-future Biotech vyvinula na základě technologie MIRA řadu produktů pro rychlé testování na místě-, včetně činidel pro rychlé uvolňování nukleových kyselin, izotermických činidel pro rychlou amplifikaci nukleových kyselin, testovacích proužků s koloidním zlatem a miniaturizovaných přenosných zařízení, čímž vytvořila celkové řešení pro{11}}rychlé molekulární testování na místě. Kromě toho technologie MIRA společnosti Amp-future nabízí aplikační výhody v kombinaci s technologií CRISPR, NGS, SNP, mikrofluidikou a dalšími.
Kromě řady produktů pro rychlé testování na místě uvedených výše, Amp-future Biotech také nabízí:
Výzkumná činidla:Poskytování reagencií surovin a technické podpory pro základní vědecký výzkum, stejně jako odkazy na projektovou literaturu.
OEM výroba:Schopnost nezávisle vyrábět vysoce{0}}čisté, vysoce{1}}aktivní hotové produkty v průběhu celého procesu a dosáhnout tak průmyslové-výroby.
Vývoj projektu:Informace o sekvencích a výsledky analýzy zarovnání sekvencí, návrh a syntéza sondy-projektových primerů, syntéza a vzorky projektových plasmidů, zprávy a výsledky projektu atd.
Pro více informací, vítejte na dotaz.