《Vývoj nového CAS13A/CAS12A-zprostředkovaného„One-Pot“ Dual Detekční test pro geneticky modifikované plodiny exprimují
Geneticky modifikované plodiny byly široce vysazeny po celém světě a mnoho zemí postupně zlepšilo svá regulační opatření, aby byla zajištěna bezpečnost geneticky modifikovaných plodin. Vývoj rychlých a přesných metod genetické detekce na místě je velmi důležitý pro zemědělství a biologickou bezpečnost a může zmírnit obavy veřejnosti o geneticky modifikovaných produktech.
V této studii vyvinula výzkumná skupina novou reakci na jedno pot -- Mira Dual Detection v kombinaci s duálním CRISPR (MR-DCA metoda) pro současnou detekci CAMV35 a NOS genetických cílů v geneticky modifikovaných plodinách, což poskytuje jednoduchou a účinnou metodu detekce pro detekci geneticky modifikovaných plodin.
Experimentální metody
Duální produkt Mira je analyzován duálním systémem Cas13A a Cas12A za účelem generování dvou nezávislých signálů, které se navzájem nestříkají, a poté je fluorescenční barva čtena osvětlovým nástrojem nebo testovacím proužkem se dvěma T liniemi, aby se dosáhlo dvojího kanálu. Celý proces je dokončen za méně než 35 minut, s detekčním limitem až 20 kopií.
(Princip detekce MR-DCA CAMV35S a NOS)
Celý experiment je rozdělen do tří kroků: Amplifikace Mira, reakce CRISPR a dvě metody interpretace výsledků.
Gen CAMV35S se používá jako cíl CAS13A a gen NOS se používá jako cíl Cas12a. Byly navrženy dva páry primerů Mira. Systém CAS13A rozpoznává pouze RNA, takže je navržena oblast dopředného primeru, která obsahuje promotor T7 pro následnou transkripci a aktivaci Cas13a. Do genu NOS se přidá PAM. Výše uvedené přírůstky zajišťují, že jak proteiny Cas13a, tak Cas12A se mohou vázat na jejich příslušné CRRNA a mezi oběma systémy nedochází k interferenci ani křížové reakci.
Experimentální situace
Citlivost a specifičnost
Vzorek byl zředěn v gradientu pro testování intenzity fluorescence MIRA reakce. Bylo zjištěno, že intenzita fluorescence může být stále detekována při koncentraci vzorku 20 ul. Koncentrace 20 μl byla konečně vybrána pro experiment.
(Pro výpočet vývoje a kvantifikace intenzity se používají různé koncentrace vzorku a testovací proužky)
Pro další vyhodnocení specifičnosti MR-DCA výzkumný tým testoval smíšené vzorky netransgenních zvířat a netransgenních rostlin. Výsledky ukázaly, že pouze transgenní vzorky obsahující CAMV35 a NOS měly vysoké fluorescenční signály, zatímco intenzita fluorescence jiných vzorků byla blízká intenzitě negativní kontroly. MR-DCA lze použít jako specifická platforma pro detekci nukleových kyselin s dvojitou cílem.
24 vzorků plodin bylo testováno pomocí MR-DCA. Mezi nimi jsou 1, 2, 15, 16, 21 a 22 transgenní kukuřice obsahující promotor CAMV35. 7, 8, 23 a 24 jsou transgenní rýže odolná proti nemoci obsahující Terminátor NOS. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 a 18 jsou transgenní sójové boby obsahující promotor CAMV35 a Terminátor NOS.
(Výsledky testu 24 vzorků)
Rychlá reakce
Reakční doba je důležitým faktorem při detekci na místě. Výzkumný tým poznamenal, že fluorescenční signály FAM a HEX by mohly být detekovány fluorescenčním nástrojem, když byla reakční doba 10 minut. MIRA v kombinaci s reakcí CRISPR také pozorovala žlutou fluorescenci po 15 minutách.
(Fluorescenční signál v různých reakčních dobách MIRA)
(Vývoj barev testovacích proužků v různých reakčních dobách MIRA a výpočet kvantifikace intenzity)
Experimentální závěr
Experimentální výsledky ukázaly, že duální mira má dobrou specificitu a může přesně získat amplifikační produkty CAMV35 a NOS. Systémy CAS13A a CAS12A reagují nezávisle, aniž by navzájem zasahovaly. Test MR-DCA může přesně detekovat 20 kopií při nízké teplotě 35 minut, což má velkou hodnotu při detekci geneticky modifikovaných plodin v poli.
Informace o článku
Jméno časopisu: 《Journal of Advanced Research Express
Název článku: 《Vývoj nového testu „One-Pot“ pro geneticky modifikované plodiny expresní
Dopadový faktor: 11.4
Výzkumný tým: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences