Akutní respirační infekce jsou u dětí běžná respirační onemocnění, často způsobená viry. Respirační syncytiální virus (RSV) a respirační adenovirus (ADV) jsou dva běžné patogeny způsobující akutní respirační infekce u dětí. Mírné případy mohou způsobit běžné symptomy nachlazení, jako je kašel a rýma, zatímco závažné případy mohou způsobit závažné komplikace, jako je pneumonie a otitis média. Podle doporučení Světové zdravotnické organizace musí být detekce patogenů rychlá, přesná, citlivá a specifická a neměla by se spoléhat na specializované techniky nebo velké nástroje. Proto je zvláště důležité vyvinout metodu detekce pro RSV a ADV, která může splňovat výše uvedené požadavky na detekci.
Výzkumná skupina ředitelky Ma Dongli z Pediatrics v dětské nemocnici Shenzhen zveřejnila článek „Amplifikační test multiplexní rekombinázy polymerázy kombinovaný s CRISPR/ CAS12A pro detekci respiračního syncytiálního viru a dýchacího adenoviru“ v časopise „Scientific Zprávy“, s dopadovým faktorem 4.6.
Přehled výzkumu
Technologie amplifikace amplifikace nukleové kyseliny s více enzymy MIRA je kombinována se systémem detekce CRISPR/CAS. Navrhováním primerů a CRISPR RNA (CRRNA), provedením vícenásobného porovnání sekvencí, optimalizací reakčních podmínek a pomocí fluorescenčních numerických detekčních zařízení k ověření citlivosti a specificity.
A pomocí výsledků QPCR jako kontroly srovnání byla studována konzistence výsledků testu 160 klinických vzorků v krku.
Experimentální výsledky
1. Citlivost a specifičnost metody detekce miRA-CRISPR/CAS12A
Při detekci metody MIRA se dvojice primerů RSV-F1/R1 používá k amplifikaci nukleových kyselin ze vzorků krku, ADV, PIV, RHV, MP, CP, Flub, HMPV, FLUA nebo RSV/ADV ko-infikovaných pacientů. S výjimkou RSV a ADV, které měly amplifikované pásy, byly další výsledky negativní, což naznačuje, že vybrané primery MIRA nereagovaly s ostatními osmi testovanými patogeny a byly dobře konzervované.
Následně byly rekombinantní plazmidy RSV a ADV zředěny 10krát pomocí sterilní vody a detekční limity pro RSV a ADV byly oba 106kopie/ml.
(1-10: Vzorky výtěru krku od pacientů s RSV, RSV/ADV coinfection a další vzorky dýchacích patogenů)
2. Porovnejte s QPCR
Ve srovnání s metodou QPCR jsou detekční limity RSV a ADV 103 kopií/ML
(Citlivost detekce QPCR RSV a ADV)
Metoda MIRA-CRISPR je vhodnější pro základní laboratoře, s krátkou detekční dobou, jednoduchým provozem a bez potřeby rozsáhlých nástrojů QPCR k dokončení experimentálních operací.
3. Porovnání klinických vzorků
Vzorky výtěru krku byly odebrány od 160 dětí s akutními respiračními infekcemi. Současně byly pro detekci použity metoda Mira-CRISPR a metoda QPCR a výsledky byly porovnány s výsledky klinických studií.
Ve srovnání s metodou QPCR byla citlivost metody miRA-CRISPR pro RSV a ADV 98,1% a 91,4% a detekční specificita byla 1 {{6} 0%. Hodnota Kappa je větší než 0,95, což ukazuje na vysoký stupeň konzistence.
Metoda Mira-CRISPR má výhody rychlé, citlivé a specifické detekce RSV a Adv. Může detekovat virové infekce okamžitě a přesně a je vhodnější pro použití v oblastech s vzácnými lékařskými zdroji.